noticias

Na última década, a tecnoloxía de secuenciación xenética empregouse amplamente na investigación do cancro e na práctica clínica, converténdose nunha ferramenta importante para revelar as características moleculares do cancro. Os avances no diagnóstico molecular e na terapia dirixida promoveron o desenvolvemento de conceptos de terapia de precisión tumoral e trouxeron grandes cambios a todo o campo do diagnóstico e tratamento de tumores. As probas xenéticas pódense empregar para advertir do risco de cancro, orientar as decisións de tratamento e avaliar o prognóstico, e son unha ferramenta importante para mellorar os resultados clínicos dos pacientes. Aquí, resumimos os artigos recentes publicados en CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol e outras revistas para revisar a aplicación das probas xenéticas no diagnóstico e tratamento do cancro.

Mutacións somáticas e mutacións na liña xerminal. En xeral, o cancro está causado por mutacións no ADN que poden herdarse dos pais (mutacións na liña xerminal) ou adquirirse coa idade (mutacións somáticas). As mutacións na liña xerminal están presentes desde o nacemento e o mutador adoita levar a mutación no ADN de cada célula do corpo e pode transmitirse á descendencia. As mutacións somáticas son adquiridas por individuos en células non gaméticas e normalmente non se transmiten á descendencia. Tanto as mutacións na liña xerminal como as somáticas poden destruír a actividade funcional normal das células e levar á transformación maligna das células. As mutacións somáticas son un factor clave da malignidade e o biomarcador máis preditivo en oncoloxía; non obstante, aproximadamente entre o 10 e o 20 por cento dos pacientes con tumores levan mutacións na liña xerminal que aumentan significativamente o seu risco de cancro e algunhas destas mutacións tamén son terapéuticas.
Mutación impulsora e mutación pasaxeira. Non todas as variantes de ADN afectan á función celular; de media, fan falta de cinco a dez eventos xenómicos, coñecidos como "mutacións impulsoras", para desencadear a dexeneración celular normal. As mutacións impulsoras adoitan producirse en xenes estreitamente relacionados coas actividades da vida celular, como os xenes implicados na regulación do crecemento celular, a reparación do ADN, o control do ciclo celular e outros procesos vitais, e teñen o potencial de ser utilizadas como dianas terapéuticas. Non obstante, o número total de mutacións en calquera cancro é bastante grande, e vai desde uns poucos miles nalgúns cancros de mama ata máis de 100.000 nalgúns cancros colorrectais e endometriais moi variables. A maioría das mutacións non teñen ou teñen unha importancia biolóxica limitada, mesmo se a mutación se produce na rexión codificante, estes eventos mutacionais insignificantes denomínanse "mutacións pasaxeiras". Se unha variante xénica nun tipo de tumor particular predí a súa resposta ou resistencia ao tratamento, a variante considérase clinicamente operable.
Oncoxenes e xenes supresores de tumores. Os xenes que mutan con frecuencia no cancro pódense dividir aproximadamente en dúas categorías: oncoxenes e xenes supresores de tumores. Nas células normais, a proteína codificada polos oncoxenes desempeña principalmente o papel de promover a proliferación celular e inhibir a apoptose celular, mentres que a proteína codificada polos xenes oncosupresores é a principal responsable de regular negativamente a división celular para manter a función celular normal. No proceso de transformación maligna, a mutación xenómica leva á mellora da actividade dos oncoxenes e á diminución ou perda da actividade dos xenes oncosupresores.
Variación pequena e variación estrutural. Estes son os dous tipos principais de mutacións no xenoma. As variantes pequenas alteran o ADN cambiando, eliminando ou engadindo un pequeno número de bases, incluíndo a inserción de bases, a deleción, o cambio de marco de lectura, a perda de codóns de inicio, as mutacións por perda de codóns de finalización, etc. A variación estrutural é un gran rearranxo do xenoma, que implica segmentos de xenes que varían en tamaño desde uns poucos miles de bases ata a maior parte do cromosoma, incluíndo cambios no número de copias de xenes, deleción de cromosomas, duplicación, inversión ou translocación. Estas mutacións poden causar unha redución ou mellora da función das proteínas. Ademais dos cambios a nivel de xenes individuais, as sinaturas xenómicas tamén forman parte dos informes de secuenciación clínica. As sinaturas xenómicas poden verse como patróns complexos de variacións pequenas e/ou estruturais, incluíndo a carga de mutación tumoral (TMB), a inestabilidade de microsatélites (MSI) e os defectos de recombinación homóloga.

Mutación clonal e mutación subclonal. As mutacións clonais están presentes en todas as células tumorais, están presentes no momento do diagnóstico e permanecen presentes despois de que avance o tratamento. Polo tanto, as mutacións clonais teñen o potencial de ser utilizadas como dianas terapéuticas tumorais. As mutacións subclonais están presentes só nun subconxunto de células cancerosas e poden detectarse ao comezo do diagnóstico, pero desaparecen coa posterior recorrencia ou aparecen só despois do tratamento. A heteroxeneidade do cancro refírese á presenza de múltiples mutacións subclonais nun só cancro. Cabe destacar que a gran maioría das mutacións impulsoras clinicamente significativas en todas as especies comúns de cancro son mutacións clonais e permanecen estables ao longo da progresión do cancro. A resistencia, que a miúdo está mediada por subclons, pode non detectarse no momento do diagnóstico, pero aparece cando recae despois do tratamento.

A técnica tradicional FISH ou cariotipo celular utilízase para detectar cambios a nivel cromosómico. A FISH pódese empregar para detectar fusións, delecións e amplificacións xénicas, e considérase o "patrón de ouro" para detectar tales variantes, con alta precisión e sensibilidade pero cun rendemento limitado. Nalgunhas neoplasias hematolóxicas, especialmente a leucemia aguda, a cariotipificación aínda se emprega para guiar o diagnóstico e o prognóstico, pero esta técnica está a ser substituída gradualmente por ensaios moleculares dirixidos como a FISH, a WGS e a NGS.
Os cambios en xenes individuais pódense detectar mediante PCR, tanto PCR en tempo real como PCR dixital por gotas. Estas técnicas teñen unha alta sensibilidade, son especialmente axeitadas para a detección e monitorización de pequenas lesións residuais e poden obter resultados nun tempo relativamente curto; a desvantaxe é que o rango de detección é limitado (normalmente só detectan mutacións nun ou poucos xenes) e a capacidade de realizar múltiples probas é limitada.
A inmunohistoquímica (IHC) é unha ferramenta de monitorización baseada en proteínas que se emprega habitualmente para detectar a expresión de biomarcadores como ERBB2 (HER2) e receptores de estróxenos. A IHC tamén se pode empregar para detectar proteínas mutadas específicas (como BRAF V600E) e fusións de xenes específicos (como as fusións de ALK). A vantaxe da IHC é que se pode integrar facilmente no proceso de análise de tecidos de rutina, polo que se pode combinar con outras probas. Ademais, a IHC pode proporcionar información sobre a localización de proteínas subcelulares. As desvantaxes son a escalabilidade limitada e as altas esixencias organizativas.
Secuenciación de segunda xeración (NGS) A NGS emprega técnicas de secuenciación paralela de alto rendemento para detectar variacións a nivel de ADN e/ou ARN. Esta técnica pódese empregar para secuenciar tanto o xenoma completo (WGS) como as rexións xénicas de interese. A WGS proporciona a información de mutación xenómica máis completa, pero existen moitos obstáculos para a súa aplicación clínica, como a necesidade de mostras frescas de tecido tumoral (a WGS aínda non é axeitada para analizar mostras inmobilizadas en formalina) e o seu alto custo.
A secuenciación NGS dirixida inclúe a secuenciación de exóns completos e o panel de xenes diana. Estas probas enriquecen as rexións de interese mediante sondas de ADN ou amplificación por PCR, limitando así a cantidade de secuenciación necesaria (o exoma completo constitúe entre o 1 e o 2 % do xenoma, e mesmo os paneis grandes que conteñen 500 xenes constitúen só o 0,1 % do xenoma). Aínda que a secuenciación de exóns completos funciona ben en tecidos fixados con formalina, o seu custo segue sendo elevado. As combinacións de xenes diana son relativamente económicas e permiten flexibilidade na selección dos xenes que se van analizar. Ademais, o ADN libre circulante (cfDNA) está a xurdir como unha nova opción para a análise xenómica de pacientes con cancro, coñecida como biopsias líquidas. Tanto as células cancerosas como as células normais poden liberar ADN na corrente sanguínea, e o ADN liberado polas células cancerosas denomínase ADN tumoral circulante (ctDNA), que se pode analizar para detectar posibles mutacións nas células tumorais.
A elección da proba depende do problema clínico específico que se vai abordar. A maioría dos biomarcadores asociados ás terapias aprobadas pódense detectar mediante técnicas FISH, IHC e PCR. Estes métodos son razoables para a detección de pequenas cantidades de biomarcadores, pero non melloran a eficiencia da detección ao aumentar o rendemento e, se se detectan demasiados biomarcadores, pode que non haxa suficiente tecido para a detección. Nalgúns tipos de cancro específicos, como o cancro de pulmón, onde as mostras de tecido son difíciles de obter e hai varios biomarcadores para analizar, o uso de NGS é unha mellor opción. En conclusión, a elección do ensaio depende do número de biomarcadores que se van analizar para cada paciente e do número de pacientes que se van analizar para o biomarcador. Nalgúns casos, o uso de IHC/FISH é suficiente, especialmente cando se identificou o obxectivo, como a detección de receptores de estróxenos, receptores de proxesterona e ERBB2 en pacientes con cancro de mama. Se se require unha exploración máis exhaustiva das mutacións xenómicas e a busca de posibles obxectivos terapéuticos, a NGS é máis organizada e rendible. Ademais, pódese considerar a NGS nos casos nos que os resultados da IHC/FISH sexan ambiguos ou pouco concluíntes.

Diferentes directrices ofrecen orientación sobre que pacientes deberían ser elixibles para as probas xenéticas. En 2020, o Grupo de Traballo de Medicina de Precisión da ESMO emitiu as primeiras recomendacións de probas de NGS para pacientes con cancro avanzado, recomendando probas de NGS rutineiras para mostras avanzadas de cancro de pulmón non escamoso non microcítico, cancro de próstata, cancro colorrectal, cancro do conduto biliar e tumores de cancro de ovario, e en 2024, a ESMO actualizounas sobre esta base, recomendando a inclusión do cancro de mama e tumores raros, como tumores estromais gastrointestinais, sarcomas, cancros de tiroide e cancros de orixe descoñecida.
En 2022, a Opinión Clínica da ASCO sobre as probas do xenoma somático en pacientes con cancro metastásico ou avanzado afirma que, se se aproba unha terapia relacionada con biomarcadores en pacientes con tumores sólidos metastásicos ou avanzados, recoméndase realizar probas xenéticas para estes pacientes. Por exemplo, débense realizar probas xenómicas en pacientes con melanoma metastásico para detectar mutacións BRAF V600E, xa que os inhibidores de RAF e MEK están aprobados para esta indicación. Ademais, tamén se deben realizar probas xenéticas se existe un marcador claro de resistencia para o fármaco que se lle vai administrar ao paciente. O Egfrmab, por exemplo, é ineficaz no cancro colorrectal con mutación KRAS. Ao considerar a idoneidade dun paciente para a secuenciación de xenes, débese integrar o estado físico do paciente, as comorbilidades e o estadio do tumor, porque a serie de pasos necesarios para a secuenciación do xenoma, incluído o consentimento do paciente, o procesamento de laboratorio e a análise dos resultados da secuenciación, requiren que o paciente teña unha capacidade física e unha esperanza de vida adecuadas.
Ademais das mutacións somáticas, nalgúns tipos de cancro tamén se deben realizar probas para detectar xenes da liña xerminal. As probas para detectar mutacións da liña xerminal poden influír nas decisións de tratamento para cancros como as mutacións BRCA1 e BRCA2 en cancros de mama, ovario, próstata e páncreas. As mutacións da liña xerminal tamén poden ter implicacións para o cribado e a prevención futuros do cancro en pacientes. Os pacientes que son potencialmente axeitados para as probas de mutacións da liña xerminal deben cumprir certas condicións, que inclúen factores como antecedentes familiares de cancro, idade no momento do diagnóstico e tipo de cancro. Non obstante, moitos pacientes (ata o 50 %) que portan mutacións patóxenas na liña xerminal non cumpren os criterios tradicionais para as probas de mutacións da liña xerminal baseadas nos antecedentes familiares. Polo tanto, para maximizar a identificación de portadores de mutacións, a Rede Nacional Integral do Cancro (NCCN) recomenda que todos ou a maioría dos pacientes con cancro de mama, ovario, endometrio, páncreas, colorrectal ou próstata se sometan a probas para detectar mutacións da liña xerminal.
En canto ao momento das probas xenéticas, dado que a gran maioría das mutacións impulsoras clinicamente significativas son clonais e relativamente estables ao longo da progresión do cancro, é razoable realizar probas xenéticas en pacientes no momento do diagnóstico de cancro avanzado. Para probas xenéticas posteriores, especialmente despois dunha terapia molecular dirixida, as probas de ctDNA son máis vantaxosas que o ADN do tecido tumoral, porque o ADN sanguíneo pode conter ADN de todas as lesións tumorais, o que é máis propicio para obter información sobre a heteroxeneidade do tumor.
A análise do ctDNA despois do tratamento pode ser capaz de predicir a resposta tumoral ao tratamento e identificar a progresión da enfermidade antes que os métodos de imaxe estándar. Non obstante, non se estableceron protocolos para usar estes datos para guiar as decisións de tratamento e non se recomenda a análise do ctDNA a non ser que se realice en ensaios clínicos. O ctDNA tamén se pode usar para avaliar pequenas lesións residuais despois dunha cirurxía tumoral radical. As probas de ctDNA despois da cirurxía son un forte predictor da progresión posterior da enfermidade e poden axudar a determinar se un paciente se beneficiará da quimioterapia adxuvante, pero aínda non se recomenda usar o ctDNA fóra dos ensaios clínicos para guiar as decisións de quimioterapia adxuvante.

Procesamento de datos O primeiro paso na secuenciación do xenoma é extraer ADN de mostras de pacientes, preparar bibliotecas e xerar datos de secuenciación brutos. Os datos brutos requiren un procesamento adicional, incluíndo o filtrado de datos de baixa calidade, a súa comparación co xenoma de referencia, a identificación de diferentes tipos de mutacións mediante diferentes algoritmos analíticos, a determinación do efecto destas mutacións na tradución de proteínas e o filtrado das mutacións da liña xerminal.
A anotación do xene controlador está deseñada para distinguir as mutacións do condutor e do pasaxeiro. As mutacións do condutor provocan a perda ou a mellora da actividade dos xenes supresores de tumores. As variantes pequenas que provocan a inactivación dos xenes supresores de tumores inclúen mutacións sen sentido, mutacións por desprazamento do marco de lectura e mutacións clave no sitio de empalme, así como a eliminación menos frecuente de codóns de inicio, a eliminación de codóns de finalización e unha ampla gama de mutacións de inserción/deleción de intróns. Ademais, as mutacións con sentido erróneo e as pequenas mutacións de inserción/deleción de intróns tamén poden provocar a perda da actividade dos xenes supresores de tumores cando afectan a dominios funcionais importantes. As variantes estruturais que provocan a perda da actividade dos xenes supresores de tumores inclúen a eliminación parcial ou completa de xenes e outras variantes xenómicas que provocan a destrución do marco de lectura dos xenes. As variantes pequenas que provocan unha mellora da función dos oncoxenes inclúen mutacións con sentido erróneo e insercións/delecións ocasionais de intróns que se dirixen a dominios funcionais importantes das proteínas. En casos raros, o truncamento de proteínas ou as mutacións no sitio de empalme poden provocar a activación dos oncoxenes. As variacións estruturais que provocan a activación dos oncoxenes inclúen a fusión de xenes, a eliminación de xenes e a duplicación de xenes.
A interpretación clínica da variación xenómica avalía a importancia clínica das mutacións identificadas, é dicir, o seu potencial valor diagnóstico, prognóstico ou terapéutico. Existen varios sistemas de clasificación baseados na evidencia que se poden empregar para guiar a interpretación clínica da variación xenómica.
A Base de Datos de Oncoloxía de Medicina de Precisión (OncoKB) do Centro Oncolóxico Memorial Sloan-Kettering clasifica as variantes xenéticas en catro niveis segundo o seu valor preditivo para o uso de fármacos: Nivel 1/2, biomarcadores aprobados pola FDA ou clinicamente estándar que predicen a resposta dunha indicación específica a un fármaco aprobado; Nivel 3, biomarcadores aprobados ou non aprobados pola FDA que predicen a resposta a novos fármacos dirixidos que demostraron ser prometedores en ensaios clínicos, e Nivel 4, biomarcadores non aprobados pola FDA que predicen a resposta a novos fármacos dirixidos que demostraron evidencia biolóxica convincente en ensaios clínicos. Engadiuse un quinto subgrupo asociado coa resistencia ao tratamento.
As directrices da Sociedade Americana de Patoloxía Molecular (AMP)/Sociedade Americana de Oncoloxía Clínica (ASCO)/Colexio de Patólogos Americanos (CAP) para a interpretación da variación somática dividen a variación somática en catro categorías: Grao I, con forte significación clínica; Grao II, con posible significación clínica; Grao III, significación clínica descoñecida; Grao IV, descoñecida a súa importancia clinica. Só as variantes de grao I e II son valiosas para as decisións de tratamento.
A Escala de Operabilidade Clínica de Dianas Moleculares (ESCAT) da ESMO clasifica as variantes xénicas en seis niveis: Nivel I, dianas axeitadas para o uso rutineiro; Fase II, unha diana que aínda se está a estudar, probablemente se utilizará para cribar a poboación de pacientes que poderían beneficiarse do fármaco diana, pero necesítanse máis datos para respaldalo. Grao III, variantes xénicas dirixidas que demostraron beneficio clínico noutras especies de cancro; Grao IV, só variantes xénicas dirixidas respaldadas por evidencias preclínicas; No grao V, hai evidencias que respaldan a importancia clínica de dirixirse á mutación, pero a terapia con fármaco único contra a diana non prolonga a supervivencia ou pódese adoptar unha estratexia de tratamento combinado; Grao X, falta de valor clínico.